多重PCR

     一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和 操作过程与一般PCR相同.
多重 PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中 同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，，可系统组合的有:①肝炎病毒的感染，在同 一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道 致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.④战 伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.
某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.
多重PCR的特点有:①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原 体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便 性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.

PCR 反应体积为 25μL ，包括：灭菌的超纯水、 PCR 缓冲液 (1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因组 DNA 模板 (150ng/25μL) 。先加入水，其它组分可以任意顺序加入，加样在冰上进行，加样完成后反应管直接从冰上转入预热到 94 ℃的循环仪加热模块或水浴中。对于放射性标记的反应，在反应开始前立即在 100μL 的反应混合液中加入 1 μCi dNTP。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反应体积得到的结果相同，对于小的反应体积，加样（尤其是 dNTP ）至关重要。1、 DNA 引物：引物的选择遵从简单的规则：引物长度为 18-24bp 或更长， GC 含量为 35%-60% ，退火温度 55 ℃ -58 ℃或更高。长些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特 异性产物。 2、 单基因的 PCR：首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括： 1xPCR 缓冲液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反应体积。将在同一台 PCR 仪，在同型号的不同 PCR 仪上，在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增，实验的重复性很好，但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异，但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物，通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应，退火时间与延伸时间并不明显影响结果，但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。
3、 多重 PCR （等物质量的引物混合物）：将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化。初次进行多重反应时，各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。

同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。
1. DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。
2. DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。
3. 多重PCR扩增：反应体系可以选定为20μl，50μl等，反应体系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，Taq DNA聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，多重PCR技术是在扩 增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参 数要尽量少，以利于检测扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA片段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使Taq酶的消耗 增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。
4. 电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml E、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。

延伸温度：上图展示了当加入相等量 (0.4 μM each) 的四种用于扩增 Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时，用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果，程序 B 有更高的延伸温度 (72 ℃ ) 和更长的退火和延伸时间。总的来说，用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量的 PCR 产物。此外，用程序 B 扩增时某些产物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同时出现了某些非特异性的扩增产物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的结果更差一些，表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增，尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。
延伸时间：在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。在一个实验中，一对 Y 染色体引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色体引物混合物 (X-3) 中。结果表明，多重 PCR 中增加延伸时间 ( 程序 A 与程序 D) 可以增加较长的 PCR 产物的产量。在另一个实验中，用程序 C 和 A扩增四个 Y 染色体上的基因。当延长延伸时间时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。
退火时间和退火温度 ：将 退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 ℃ –60 ℃被特异的扩增，我们的经验表明 将退火温度降低 4 ℃ –6 ℃对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。单独扩增时退火温度为 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火温度为 54 ℃时最优。尽管在 54 ℃时可能出现非特异性扩增，但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使 扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。
PCR 循环数：引物混合物 Y-3* 被用于扩增两个不同的基因组 DNA 样品，以不同的循环次数做多次实验。其中的一个基因组模板质量更高或 DNA 含量更高。可以看出，当循环数增加时，两组样品的各扩增带的产量都逐渐增加。 PCR 产物量增加最明显是在 25 个循环附近。通常对于一个反应， 28 至 30 个循环足矣，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。

多重PCR技术可应用于生物学研究的多个领域，如病原体鉴别、性别筛选、遗传性疾病诊断、法医学研究以及基因缺失、突变和多态性分析等等。多重PCR 技术作为一种可靠的检测基因序列的缺失或突变的方法，在假肥大性肌营养不良症(DMD)的诊断中得到应用。半数的DMD病人是由于Dystrophin基 因的部分缺失所引起的，根据Dystrophin基因中易于缺失的9个区域的序列，设计合成一系列引物，同一实验中同时扩增这9个区段，电泳分析。正常人 多重PCR电泳图谱为9个片段，如果Dystrophin基因中的某一个区段缺失，那么在PCR电泳图谱上就没有相应的条带，据此可以诊断DMD。
随着PCR技术的发展，多重PCR技术已经取代了较为烦琐的Southern印迹杂交来检测基因的突变或缺失。应用多重PCR技术，在同一反应管中可以同时检测分析多种目的DNA序列，既节约了实验样本和试剂，而且使操作更加简便，省时省力。
与常规的PCR技术相比，多重PCR技术涉及到了多对引物，随着引物对数的增加，也增加了得到错配的扩增产物的机会，因此，需要根据实验的要求、目的 以及所设计的引物等等因素，对反应条件进行优化，对多重PCR中的各种影响因素进行组合、调整，以寻找到一个最优的扩增条件，从而可以进行高度特异性的多 重PCR，这在对病原微生物的基因检测和临床诊断方面有着十分重要的意义。