SDS-PAGE,蛋白转印，western Blot试剂配制

dr.qinan

试剂中文名	试剂英文名	备注
Tris碱	Tris, base	MW 121.14
丙烯酰胺	Acrylamide	生工F-2：100g, 140元，BBI产，Cat#: AB1032
双丙烯酰胺	Bis- Acrylamide	生工：Cat#: BB0025
	SDS	生工F-110：1g, 55元，AMRESCO产，Cat#: S0485
	TEMED	生工：150 ml, 86元，BBI产，Cat#: T0761
过硫酸胺(APS)	Ammonium Persulfate	华舜：25g, 42元，Sigma产，Cat#:A6761
甘氨酸	Glycine
二硫苏糖醇	DTT	生工F-47：1g, 55元，BBI产，Cat#: DB0058
溴酚蓝	Bromophenol Blue,Na	华舜：5g, 70元，AMRESCO产，Cat#: 0312
土温20	TWeen 20
甘油	Glycerol
甲醇
无水乙酸钠
蛋白电泳Marker	(高范围)	华舜
蛋白电泳Marker	(20~220 kd)	Invitrogen, Cat#: LC5602. (敖永琴, 2270元)
丽春红S	Ponceau S	华舜也有售，10g, 72元。
氟化钠	NaF
脱脂奶粉		上海光明牌（Wu XJ用）
	western blot striping buffer	PIERCE公司, Cat#: 21059, 吉泰（1043元）、基因公司代理。

SDS-PAGE、蛋白转印、Western Blot试剂原料一览表

SDS-PAGE、蛋白转印、Western Blot试剂配制

(***整理，2004.9.6)

1.5 mol/L Tris (PH8.8)

1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．用浓盐酸调节pH值至8.8。

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

（参照kara公司Catalog-N1）

1 mol/L Tris (PH6.8)

1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值	浓HCl
6.8
7.4	约70 ml
7.6	约60 ml
8.0	约42 ml

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

（参照kara公司Catalog-N1）

30％丙稀酰胺（100ml）

1．称量下列试剂置于烧杯中。

丙烯酰胺（Acrylamide）	29 g
双丙烯酰胺 (BIS)	1 g

2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。

5．于棕色瓶中4
oC保存。

注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

30％ SDS

1．称量10 g
高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。

3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。

4．定容至100 ml，室温保存。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

10％ 过硫酸铵

1．称量1 g过硫酸铵。

2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。

3．储存于4oC。

注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。

（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

1×SDS凝胶加样缓冲液

50 mmol/L	Tris·Cl (pH 6.8)
100 mmol/L	DTT
2%	SDS （电泳级）
0.1%	溴酚蓝
10%	甘油

不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。

（参照《分子克隆》二版P884）

本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。

另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：

组分浓度：

250 mmol/L	Tris·Cl (pH 6.8)
10% (W/V)	SDS （电泳级）
0.5% (W/V)	溴酚蓝（BPB）
50% (V/V)	甘油
5% (W/V)	β-巯基乙醇（2-ME）

配制量 5 ml

配制方法

1．称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。

1 M Tris·Cl (pH 6.8)	1.25 ml
SDS （电泳级）	0.5 g
溴酚蓝（BPB）	25 mg
甘油	2.5 ml

2．加去离子水溶解后定容至5 ml。

3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。

4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。

5．加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。

1 mol/L DTT (20 ml)

1．称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。

2．加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。

3．分装后－20oC保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

3 M
醋酸钠（NaOAc）（100 ml）

1．称取40.8 g NaOAc·3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。

2．加冰醋酸调节pH值至5.2。

3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

0.01 M NaOAc (pH5.2)
参照此配方配制。

5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）

组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS

1．称量下列试剂置于烧杯中。

Tris	15.1 g
Glycine	94 g
10%(W/V) SDS（电泳级）	50 ml

2．加入约900 ml去离子水搅拌溶解。

3．定容至1L，室温保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

Transfer Buffer:

[自配] Transfer Buffer:500ml

25mM Tris base, 0.2M glycine（甘氨酸）, 20% methanol(甲醇PH8.5)

先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,PH约11

1M 12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol
+ ddH2O 至400ml,调好PH值，再加ddH2O至500ml.

先置于4oC保存备用。

（参照吴兴军给Protoco, 据说优于《分子克隆》配方）

丽春红S储存液（10×）

丽春红S	2 g
三氯乙酸	30 g
磺基水杨酸	30 g
加水至100 ml。

用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液，使用后应予废弃。

10X TBS (Tris-buffered saline):

To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).

（参照Cell signal Technology Protoco）

Wash Buffer TBS/T:

1X TBS, 0.1% Tween-20

[自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml

1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20
+ 900ml ddH2O

（参照Cell signal Technology Protoco）

Blocking Buffer:

1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。

[自配 Blocking buffer:150ml

for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add 7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).

(现用现配，4oC储存备用)

（参照Cell signal Technology Protoco）

Primary Antibody Dilution Buffer:

1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;

for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).

（参照Cell signal Technology Protoco）