Real time PCR试剂质量的评价

dr.qinan

临床使用PCR定量检测核酸，由于手工操作多、影响因素多，质量控制比较困难，在增强操作能力和仪器设备的基础上，选择好的PCR试剂是保证检测质量非常重要的关键。
一、通过实时荧光PCR扩增曲线评价
【扩增曲线图解读】实时荧光PCR由于每个循环要监测荧光信号值，因此都有拟合好的扩增曲线，通过扩增曲线可以很直观、准确的了解和评判试剂质量的好坏。认真研究扩增曲线图可以看出非常多的问题，基本上可以判定试剂的质量。下图是一张非常漂亮的扩增曲线图：

从上图可以看出几个问题：
1.
总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.
曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。
3.
基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。
4.
曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。
5.
低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。
【仪器差异】扩增曲线图与仪器的原理和性能有很大关系，一方面仪器的原理决定了仪器的优缺点，另一方面仪器的的软件拟合方式不同也决定了仪器曲线图的不同，因此只有同一种仪器的扩增曲线图才能反应和比较试剂的质量。下图是同一种试剂在不同仪器上的扩增曲线图：

1． 由于仪器检测原理不同，拟合方式不同，因此不能用不同仪器间的斜率来判断扩增效率的好与坏。
2． 但从各自曲线的平行性来看，5700的表现要弱于LC，这除了偶然误差外，与LC使用离心空气加热、所有管的温度一致而5700使用半导体加热，温度一致性要弱于LC有关。同时毛细管导管强与薄壁管也是一个影响因素。
【比较试剂】使用扩增曲线图比较试剂一定要在同一仪器上，下图是三种试剂在5700上的扩增曲线：

1． 从上图可以看出前两种试剂表现比较好，而第三种试剂就明显质量差了很多。
2． 从基线看，第三种试剂基线上线，阴性结果易被误判。扩增效率低、且严重不一致，定量结果重复性和准确性肯定不好。低浓度表现不佳，灵敏度肯定会低。
二、实验验证评估试剂质量指标
由于PCR试剂是由提取和扩增两步进行的，扩增曲线能看出大部分问题，但不能看出全部问题。因此完善全面的评估还要专门进行实验设计来验证试剂质量的指标，同时设计实验后的扩增曲线也更能说明问题。
【灵敏度】各厂家公布的灵敏度都差不多，但实际情况真是如此吗？这需要实验验证。比较灵敏度的高低，最好的办法就是使用一高浓度的标准，稀释成梯度系列，使用不同试剂同时去检测，看谁能检出的稀释度高，谁灵敏度好。除去偶然因素，结果一般都与扩增曲线的判断一致。
【特异性】做非常多的阴性标本，看检测结果，与扩增曲线走势一致。
【重复性】重复性有两种做好，一种是对同一标本进行多数检测(包括提取)，计算CV值，越小越好。别一种就是利用灵敏度的梯度曲线算线性，越近似于1越好。
【其他】诸如稳定性实验等一般不是特别重要可以忽略。

要公平、公正的评价试剂质量，要注意使用相同的标本同时检测，以排除标本降解等因素影响。实验标本数量要大，才能有代表性。另外，在分析结果的时候要考虑到偶然误差以及操作人员试剂熟悉程度差等的影响