基因敲除小鼠构建（转）

dr.qinan

四川大学基因工程小鼠中心关于基因敲除技术的扫盲技术帖




一、基因打靶技术的概念
基因打靶技术（gene targeting mutation）,又称为knock out技术，是建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell）与同源重组技术（homologous recombination）基础上的一种定向改变生物体遗传信息的实验手段。通过对生物体染色体基因组遗传信息的定向改造，使改造后的性状表达,并使改造后的遗传信息在生物活体内遗传，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，了解疾病发生的分子机制，并提供相关疾病治疗的药物、评价整体动物模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段之一。

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小鼠基因敲除技术——二、基因打靶技术的背景




目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将人工改造过的基因导入靶细胞内。但由于这些导入的人工改造过的基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，且多拷贝串联重复，可能导致下面几种情况出现：
① 导入的外源基因整合入某一正常基因内，导致该正常基因发生插入突变，影响该基因正常的表达和功能；
② 导入的基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；
③ 基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；
④ 导入的基因由于其整合位点不恰当，而在细胞内不表达或表达难以控制;
⑤ 基因插入的拷贝数不能控制等。

原核注射法构建转基因小鼠 构建基因打靶小鼠
载体 需要特定的启动子，PolyA终止信号等 选择标记基因，同源臂
导入目标 受精卵雄性原核 胚胎干细胞
整合位点 随机整合，染色体基因组各个位点 定向整合
拷贝数 多个拷贝 单拷贝
片段整合时重复次数 首尾串联重复 单个，无串联重复
（表4-2，通过原核注射法构建转基因小鼠和基因打靶小鼠优缺点的比较）

为了克服上述缺点，最好用基因打靶技术将外源基因导入预先确定的位点，即对细胞内靶位点进行定点修饰，从而研究该基因的功能或在生物体中的作用。随着人类基因组计划（HGP）及四十多种低等生物基因组测序的完成，定向改变生物体遗传信息已成为可能。对发现的大量未知功能的新基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向改造，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶日益成为继转基因技术后新发展起来的一个热门研究领域，是研究特定基因在动物整体水平的一项重要技术。
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(general recombination)，指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶通常是用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相似的基因发生同源重组,使目的序列整合至受体细胞基因组中并得以表达。
胚胎干细胞（embryo stem cell）是一类具有向各种系统细胞分化转变潜能并保持高度未分化状态的全能干细胞。自从1981年美国的Gail和英国的Evans等分别成功地从发育中的小鼠囊胚的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群，称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞。胚胎干细胞注入囊胚腔内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织。
正是由于胚胎干细胞的这种特殊性，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再经适当交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。

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小鼠基因敲除技术——三、基因打靶技术




传统基因打靶技术是通过DNA同源重组直接将靶基因在细胞或动物个体中的活性完全消除。进行完全的基因敲除首先是在体外进行目的基因功能的缺失突变，即构建携带突变基因的打靶载体。然后将携带突变基因的打靶载体通过各种方法导入胚胎干细胞或体细胞中，通过同源重组的方法将基因组中的野生型基因置换下来。
在传统的基因敲除过程中，由于敲除小鼠所有细胞基因组上都存在该基因的缺失或突变，若该基因是调节发育过程的重要成员，其缺失往往引起严重的发育缺陷或胚胎死亡，导致后续工作无法开展。即使发育完整的突变体小鼠，对于敲除后表型的分析常遇到两个困难：一是所有体细胞基因的剔除，很难将异常的表型归于哪一类细胞或组织；二是很难区分该表型是由胚胎期形成还是在成体期形成。此外，由于广泛应用NEO和HSV-tK作为正负选择系统，发生同源重组的细胞基因组中总留有外源选择标记基因；该基因可能影响相邻基因的表达，不利于对突变表型的精确分析。基于Cre/LoxP系统的条件性基因打靶(conditional gene targeting)可克服上述局限性。该方法主要是在打靶载体上将需要改造的目的片段置于同向LoxP位点之间，经在电转化ES细胞后进行同源重组及筛选，阳性ES细胞经囊胚注射后进行胚胎移植，将携带该载体的小鼠与受控于组织特异性启动子或诱导性启动子的Cre基因的转基因小鼠交配，经Cre酶介导Loxp位点之间发生重组，即可获得靶基因在某一组织器官或不同发育时期上缺失的敲除小鼠。
条件基因打靶特点如下：
① 条件性基因敲除，研究完全敲除具有胚胎致死效应基因的功能及基因在特定组织细胞或个体发育特定阶段的功能；
② 通过激活受组织特异性 控制的Cre酶表达，实现转基因的时间-空间范围内的可控制性表达；
③ 通过Cre酶切除条件性基因修复(Cre excision-conditional gene repair)，进行基因的可修复性敲除，以研究一个基因的多种功能。
因此，当对一个功能已知，缺失并不会出现胚胎致死效应的基因进行敲除，并且只是希望简单的构建此基因敲除的模型而进行后续实验的话，可以选择使用传统的基因打靶技术，这样可以节约时间和成本。但是往往我们需要敲除的基因其功能都是未知的，需要使用基因打靶技术将其敲除后进行研究，那么此时就需要用到条件性基因打靶技术，这样可有效的避免未知基因缺失可能导致的胚胎致死效应，同时还能达到特定时间和特定组织特异性敲除的功能。

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小鼠基因敲除技术——四、打靶载体的构建




(一)打靶载体构建的通用原则
  打靶载体设计是进行基因打靶的第一步，也是最基本的一部。设计前必须思考一下几个方面的问题：
① 载体类型选择置换型载体还是用插入型载体？
② 打靶载体中同源臂设计多长比较合适？
③ 同源臂选用等长同源臂还是长短臂结合的构造？
④ 用同系小鼠（一般为129x1/svj）DNA还是非同系的DNA作为模板构建打靶载体？
⑤ 标记基因的选择是根据筛选的方法还是用富集的方法获得中靶的ES细胞？
⑥ 如果条件性打靶载体设计，LoxP序列在打靶载体中的位置如何放置？
⑦ 如何更有效的在LoxP位点发生重组后能有效的终止目的基因的表达？
基因打靶载体的基本结构包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等外源性序列，其中同源序列（同源臂）是同源重组效率的关键因素 [如图4-9]。打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列重复，从而干扰目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

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小鼠基因敲除技术——四、打靶载体的构建



(二)打靶载体的其他构件

(1)阳性克隆筛选基因：
正选择标记基因
选择标记基因 英文缩写 来源 正选择药物
新霉素磷酸转移酶 neo 细菌 G418（最常用，最方便）
潮霉素B磷酸转移酶 hph 细菌 潮霉素
黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶 gpt 细菌 麦考酚酸+HAT+黄嘌呤
次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 Hprt 哺乳动物 HAT
胸腺嘧啶激酶 tk 哺乳动物 HAT
嘌呤霉素乙酰转移酶 puro 细菌 嘌呤霉素

负选择标记基因
选择标记基因 英文缩写 来源 负选择药物 宿主基因型
次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 Hprt 哺乳动物 6TG Hprt-
黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶 gpt 细菌 6TG Hprt-
胸腺嘧啶激酶 tk 哺乳动物 6TX Wt or Hprt-
白喉毒素 DT 细菌 不需要 Wt（效率最高）
单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶 HSVtk 病毒 5BdU
GANC, FIAU Tk-
wt
（表4-3，正负筛选标记基因）

(2)Cre-LoxP和Flpe-Frt重组酶系统：
Cre/LoxP和Flp/Frt系统的应用使在特定组织中进行条件性基因敲除成为可能。构建条件敲除（conditional knockout）小鼠的打靶载体，常将阳性选择标记基因置于靶基因内含子中，并在靶基因的某个或某几个外显子两侧或重要功能域（domain）两侧的内含子中插入方向相同或相反的LoxP序列，称为LoxP锚定（achor）。由于选择标记基因即便被放置在内含子中，一般不会提前影响靶基因的转录。

LoxP序列：
5’ – ATAACTTCGTATA  gcatacat  TATACGAAGTTAT – 3’
3’ – TATTGAAGCATAT  cgtatgta  ATATGCTTCAATA – 5’
              ----------------     --------------------
Loxp序列中心序列长8bp，而两侧有13bp的回文序列。中心区域的序列确定了Loxp的方向。Cre-Loxp系统中，Cre蛋白催化两个34bp长的loxp识别位点之间的重组。如当两个Loxp同向时，在Cre酶存在情况下会发生重组，从而剪切掉两个Loxp中间的序列（如外源目的基因或者外源筛选标记），只留下一个Loxp序列。
Frt 序列：
5’ – GAAGTTCCTATAC  tttctaga  GAATAGGAACTTC – 3’
3’ – CTTCAAGGATATC  aaagatca  CTTATCCTTGAAG – 5’
    ----------------     --------------------
   Flp-Frt的作用机制与Cre-loxp类似，但其效率较低。

Flp重组酶来源于酵母（Saccharomyces cerevisiae）的Flp重组酶。他作用机制与Cre/lox类似，但是重组效率没有Cre高。最近改进出了增强型的Flp重组酶（Flpe）能大大提高重组发生的效率。同样的，Flp重组酶特异性地对FRT位点极为敏感，。
为了达到在时空上调节基因打靶的目的，研究者常常将Cre基因置于配体或药物可诱导的启动子控制下，常用四环素调节系统，但存在较高的背景Cre重组酶活性。这些研究都是试图在转录水平上来控制Cre重组酶的表达从而达到在特定时段将靶基因删除的目的。另外，有研究者采用在转录后水平调节重组酶活性的策略。第一例对Cre重组酶活性真正实现时空上调节的研究1998年由Schwenk等人报道。他们应用B细胞特异的启动子将Cre-ER融合蛋白的表达限制在B淋巴细胞中，B淋巴细胞中Cre介导的重组效率高达80％。
应用Cre-LoxP系统，研究者可以在不同时间、不同空间按预期设计进行基因敲除。现阶段可利用的组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠还十分有限。对Cre转基因表达的精确控制还依赖于更多完全组织特异性表达的标志基因或启动子的筛选，基因后转录水平的调控机制及人工调控基因表达系统的进一步研究。

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小鼠基因敲除技术——四、打靶载体的构建



(3)打靶载体的设计：

1)传统打靶载体的设计方法:
传统打靶载体设计分为置换型载体设计和插入型载体的设计。
置换型载体基本元件包括：与靶位点两侧同源的同源序列臂，正选择标记基因，细菌质粒的骨架序列（包括细菌中的筛选标记，复制起点，多克隆位点等），质粒骨架上同源臂外侧的唯一线性化位点，同时还有一个负选择标记基因以通过富集方法来缩短同源重组的中靶细胞筛选的周期。重组结果是载体中的两条同源臂分别与染色体上的同源臂发生同源重组，靶基因序列被打靶载体上同源臂及其中的序列所替代，载体末端的非同源臂序列则被切除。


如图4-10所示，插入型载体又称为O型载体，在打靶过程中整个载体序列通过两个同源臂之间的同源重组插入到基因组序列中，导致基因组上野生型靶基因产生突变。其载体的基本结构元件同置换型载体类似，二者主要区别在于线性化位点不同。置换型载体的线性化位点在同源臂的外侧，插入型载体的线性化位点在同源臂序列的内部。通常插入型载体的打靶效率比置换型载体高5～10倍。但实际打靶载体构建过程中，特别是条件性敲除小鼠的构建过程中，研究者更倾向于使用置换型载体。

2)条件性打靶载体的设计方法:

（图4-11，以Pkd2 基因为例构建条件性打靶载体示意图）

条件性打靶载体的构建相对传统基因敲除载体的构建更繁琐、细致、精妙。首先，选择和ES细胞品系一致的基因组DNA用来构建打靶载体同源臂，且同源臂中间和前后至少各5k bp的序列要已经十分清楚，才能避免因序列的多态性导致的同源重组效率低下。对于同源臂的长度，同源臂越长，重组效率越高。但同源臂越长获取难度也随之增大。由于以后鉴定发生了同源重组的阳性ES细胞方便，一般都采取长短臂的设计，即短臂约2-4 kbp，长臂约 5-8kbp，但缺点是会降低同源重组的效率。
标记基因一般选择neo基因。一般的neo基因5’端携带高效的HSV启动子和增强子序列，使neo在插入基因组后的大部分位点都能有效表达。如果有条件，最好选择在neo基因两侧各放置有一个frt位点锚定的neo基因，以便在获得阳性ES细胞后，通过flpe酶的作用发生两个frt位点的重组，从而去除neo基因，以免影响对以后小鼠表型的分析等问题。
    LoxP序列在打靶载体中插入的位置也十分重要。为了降低LoxP元件对靶基因的潜在影响，应该避免将LoxP序列插入在靶基因的启动子、增强子区和内含子*近剪切位点的区域，建议至少离外显子两端（GT-AG）各250bp，最好选择放置在大的内含子中间。LoxP和标记基因间间隔的同源臂序列越长，二者共转移的概率越低，所以两个LoxP位点的间隔不宜过长，建议不要超过10k bp。但最近有文献报道，在利用Cre/LoxP进行的基因大片段缺失研究中，利用一个LoxP位点和其突变体LoxP511进行一次同源重组，最长可以重组基因组上200 k bp以上的靶基因，从而成功构建出了完全模拟人类地中海贫血症的条件性基因敲除小鼠。基于此项技术和酵母人工染色体文库（BAC libratory），可以大片段操作小鼠和人的染色体，使人源化小鼠的制备成为可能。

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小鼠基因敲除技术——五、外源DNA的导入与阳性细胞的筛选




外源DNA导入胚胎干细胞的方式主要通过显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是电穿孔法（电转化法）。DNA经过显微注射导入胚胎干细胞核需要昂贵的设备和非常熟练的技术，但这种技术可以保持细胞摄入DNA的高效性。但迄今用这种方法导入外源基因的报道却不多。电转化法的优势在于操作相对简单，不需要太昂贵的设备和专门的熟练技术员。主要缺点为转染效率低，ES细胞平均转染效率仅达10-3～10-4，同时使用正负选择结合的方法可以提高转染效率。
阳性细胞的筛选方法主要有：正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)和正相选择系统（positive selection method）。正负双向选择系统是利用正选择基因（通常为neo基因）和负选择基因（通常为HSV-tk），通过在G418和GANC中筛选出发生正确同源重组的阳性克隆。正选择基因位于同源区内，在同源重组和随机整合中均要正常表达。整合有neo基因的细胞株对G418有抗性，能在含有新霉素的培养基中被筛选出来。负选择基因位于同源区外，在同源重组时将会丢失，而在随机整合中则被保留。tk基因编码的胸腺激酶蛋白可使无毒的丙氧鸟苷GANC转变为毒性的核苷酸，从而杀死细胞，这样就可以排除随机整合的细胞，留下正确同源重组的细胞。
正相选择系统适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。利用删去了启动子和起始密码子的neor基因的同源重组，用G418筛选出含有抗性的细胞株，再用PCR法结合Southern杂交的方法来确定最后发生了基因打靶的阳性ES细胞株。用ES细胞基因组序列同源的DNA片段作为同源臂，采用正负两种筛选标记基因，通常可以达到1/10～1/100的中靶概率。

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小鼠基因敲除技术——六、中靶细胞获得突变体动物的方法


通过囊胚的显微注射和胚胎聚合法可以获得带有突变基因的小鼠。囊胚注射法只能获得嵌合体小鼠，需要通过筛选才能得到目的打靶位点嵌合到生殖腺的敲除小鼠；而通过胚胎聚合法或八细胞胚胎注射法则可获得完全ES细胞来源的胚胎发育而成的敲除基因小鼠，大大缩短生产敲除小鼠的时间。
目前为止采用最多的打靶用ES细胞系多来源于129x1/svj品系小鼠。最后获得阳性敲出小鼠后，还需要与C57BL6/J小鼠进行回交（backcross）10代以上才能得到背景为比较纯的C57BL6/J敲除小鼠，使得产生出能最后表型分析用的敲出小鼠周期大大延长。最近，采用来源于白化突变C57BL/6J野生型小鼠ES细胞越来越得到广泛的应用。基于此ES细胞系构建的敲除小鼠背景为纯C57BL/6J背景，无需纯化，使得生产基因敲出小鼠的周期大为缩短。
(一)通过囊胚显微注射法获得嵌合体小鼠
(1)供体囊胚的制备：
通常，为了获得数量较多的囊胚或小鼠数量有限时，需要通过注射激素PMSG和hCG进行超排。由于破坏了雌鼠正常的激素分泌周期，对雌鼠进行超排得到的许多囊胚是发育异常的。当所需囊胚数量较少时，可以用自然交配来获得囊胚，即选择8～10周龄的动情雌鼠与种雄鼠以2：1比例交配，第二天检查阴栓，标记为0.5d，在3.5d时中子宫中分离囊胚。
(2)囊胚的显微注射：
ES细胞的显微注射应当在视野明亮的相差显微镜下或在微分干涉相差显微镜（DIC）下进行[如图4-12]。将ES细胞注射到囊胚之前，首先要制备胚胎操作使用的针，包括转移胚胎用的移卵管，显微注射时固定胚胎用的持卵管及用于将细胞注射入囊胚的注射针。

（图4-12，囊胚注射）

(3)胚胎移植：
胚胎移植的成功率取决于注射后存活胚胎的质量和代孕母鼠的质量。移植胚胎的时间和移植部位很关键。一般有效的移植方法是将胚胎移植给稍前一天的非同步宿主，如囊胚注射后的胚胎（3.5dpc）需要移植到2.5dpc的假孕母鼠子宫内。移植时，平均每个子宫移植6～8枚，通常移植一侧子宫，在存活胚胎数量足够的前提下，可以尝试同时移植两侧子宫。

(4)获得基因打靶突变小鼠：
子宫移植手术成功后，如果出生的小鼠为嵌合体，说明该小鼠整合了来源于基因打靶后的ES细胞 [如图4-13]。通过不断筛选得到ES细胞整合到生殖腺的小鼠。雄性嵌合体一般需经过繁殖检测确定ES细胞整合到生殖系。若出生前没有显性致死突变效应，则可利用其半数后代中能得到带有突变的基因敲除小鼠或条件性敲除小鼠。此后，需要在活体动物中维持中靶的等位基因，再将新的等位基因放到可以表现其特征的遗传背景中。
(二)通过胚胎聚合法获得基因打靶小鼠
胚胎聚合法不像囊胚注射法那样需要精密而昂贵的显微注射仪，技术要求也没有囊胚注射那么高。用8细胞期的桑椹胚与ES细胞聚合，产生的嵌合体可经生殖系传递突变基因。有文献报道，用ES细胞与四倍体胚胎聚合，获得的小鼠可能是完全ES细胞来源的基因打靶小鼠。胚胎聚合法优点是在短时间内可以同时完成大量工作，不受仪器设备数量和技术员操作熟练程度的限制。缺点是对小鼠遗传背景有特殊要求，近交系小鼠获得胚胎数目有限，难以提供足够的供体胚胎。

(三)通过八细胞胚胎注射法获得完全来源于ES细胞的基因打靶小鼠

（图4-14）

八细胞胚胎显微注射法是最近新发明的一种有效产生基因打靶小鼠的方法[如图4-14]。在传统人工辅助体外受孕技术的背景下，利用精确的激光束在八细胞期小鼠胚胎的透明带上打一个小孔，使经过筛选的ES细胞刚好能进入透明袋中，和供体的八细胞胚胎融合，从而有效获得完全ES细胞来源的基因敲除小鼠。这种方法充分结合了体外受孕和前面提到的胚胎融合方法的优点，能快速有效的得到100%ES细胞来源的敲除小鼠，不用考虑嵌合体小鼠得到后到背景纯化的相关问题，大大缩短了构建基因敲除小鼠的时间，是以后基因打靶小鼠技术发展的方向。缺点是对仪器和操作人员的技术熟练程度要求高。

dr.qinan

小鼠基因敲除技术——七、阳性小鼠的基因型鉴定




经过基因打靶后的阳性小鼠需要通过剪取小鼠尾巴提取基因组DNA，再用PCR方法进行初步基因型鉴定。在PCR分析阳性的结果中，再用Southern杂交的办法进一步确定阳性小鼠。此基因型鉴定方法与第二节“转基因小鼠基因型鉴定”类似，不再赘述。需注意，与转基因小鼠基因型PCR鉴定不同的是：转基因小鼠由于整合位点的随机性，只能根据转基因片段上的序列设计引物进行PCR扩增鉴定，不能区分阳性小鼠是纯合型还是杂合型；而基因打靶后的小鼠由于在基因组上是定点整合的，整合部位的侧翼序列都是已知序列，可以据此设计引物进行PCR扩增，并可根据结果区分阳性小鼠的基因型是杂合型还是纯合型。

dr.qinan

小鼠基因敲除技术——八、基因打靶小鼠的表型分析




完成一个基因敲除小鼠后，最重要的是对获得的小鼠（包括杂合突变和纯和突变）进行细致的表型分析，从而真正达到建立敲除小鼠疾病模型的意义。在分析表型之前，研究者应该根据孟德尔遗传规律大致判断出生的小鼠出现异常的比例是否符合比例；如果小鼠大量出生后没有出现有异常表型的小鼠，则可以尝试在小鼠未出生之前对胚胎进行分析，以免排出敲除的基因存在胚胎致死的可能性。表型分析的主要方法有：
(一)常规体征指标检测
常规体征指标检测包括和同龄野生型小鼠的体重，身长，四肢发育，毛色，比例等常规数据进行检测和记录，为以后病理分析做参考。
(二)常规组织学分析：苏木素-伊红染色
取阳性敲除小鼠的各个器官组织（心，肝，脾，肺，肾，胰腺，睾丸，脑等）固定后用石蜡包埋，切片后做常规组织切片并用苏木素和伊红染色，检查各个标本有无异常，并详细记录。
(三)免疫组化、组织免疫荧光分析
在常规组织学分析的基础上，针对目的打靶基因的相关蛋白分子惊醒？进行？组织分布的定量和分布情况进行分析，从而有助于在分子水平上进行表型的辅助分析，解释可能与表型相关的分子机制。
(四)原位杂交分析
(1)普通原位杂交分析：
利用35S或这地高辛DIG标记的RNA探针对组织切片进行原位杂交，从而从RNA的转录水平上大概了解打靶基因相关分子的RNA组织分布和数量，为阐述分子机制做铺垫。
(2)整体原位杂交分析：

（图4-15，整体原位杂交）

此法适用于基因敲除后有胚胎致死效应的基因的表型分析。胚胎取出后，固定，经过预处理后进行原位杂交（方法同上），显色后既可以得出相关基因表达在整个胚胎中的情况[如图4-15]。

(五)相关病理学分析
病理学分析包括小鼠的血液指标、尿液指标、骨骼发育指标、免疫系统相关指标的测量和分析，胚胎影像学分析等。具体方向可依据目的打靶基因的前期体外实验所获得的数据，从而有目的、有根据的进行相关系统检测。不知道怎么发附件，只有全部复制上来，以上内容属于基因工程小鼠中心原创，已经录入《现代生物学实验技术》

dr.qinan

我补充点资料：
  
  
条件性打靶
条件性基因打靶(conditional gene targeting)可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法[5]。它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxP floxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

dr.qinan

诱导性打靶
诱导性基因打靶就是以Cre/loxp系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性打靶类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。其优点有：①诱导基因突变的时间可人为控制；③可避免因基因突变而致死胎的问题②在2个loxP位点之间的重组率较高；①如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。如果在Cre—ERT和Ad—Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。

drjiangbo

很及时呀，最近在写转基因动物模型的课题，不懂

dr.qinan

那你要好好学习，顺便把你学习中查到的资料，也传到这里来，我们一起学啊。我最近也在写这些东西。

Dr.LinZhen

我也正在写中文版，有这些就容易写很多了。呵呵