RNA干扰（RNAi）实验原理与方法选择

Dr.LinZhen

近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA 降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离 siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何进行RNAi试验
(一)siRNA的设计
1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesignInit.do
2.RNAi目标序列的选取原则：
(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：
http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html
http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html
http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

Dr.LinZhen

(二)siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。
1． 化学合成生产siRNA
优点：方便，研究人员几乎不需要做什么工作。
缺点：价格较贵，效率只有转录合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持续时间短，对细胞毒性大，转染效率低，此外由于合成工艺上存在不可弥补的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能纠正合成中产生的20%左右的碱基错误。
适用于：建议不再采用此种合成方法。
不适用于：基本上对目前所有的实验室来说均不适用。
评价：☆☆☆☆☆
2． 生物合成转录生产编码siRNA
优点：价格较低，抑制效率高，低浓度的siRNA即可达到抑制效果。体外转录合成，比较接近生理状态。
缺点：无法保证有效性，实验规模受到限制，不能进行大量的生产，不能维持长时间抑制效应，而且需要用户参与操作，难以保证实验的一次成功性。
适用于：筛选siRNAs特别是需要制备多种siRNAs，考虑合成价格时。
不适用于：实验需要大量的一个特定的siRNA。长期研究。
评价：★★★☆☆
3． Dicer酶法生产siRNA
优点：可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步骤，节省时间和开支。
缺点：有可能引发非特异性的基因沉默，尤其是同源或者密切相关的基因。
适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长期研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究
评价：★★★☆☆
4．编码shRNA的载体生产siRNA
优点：制备质量可控性好，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，可以大量扩增。
缺点：转录后的shRNA的正确折叠率不能保证，有可能因此造成非特异性抑制，质粒载体转染效率不稳定，与细胞类型有关。
适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作
评价：★★★★☆

Dr.LinZhen

5．病毒粒子生产shRNA
优点：易于制备、纯化、浓缩,宿主范围广,感染率高,理化性质稳定,不整合宿主基因组,遗传毒性和免疫毒性低，是目前最好的RNA干扰技术之一。
缺点：耗费时间比较长，即使是用最快的也得60天左右，对实验条件要求较高，容量偏小，有可能伴随部分炎症反应。
适用于：转染效率低无法解决，需要维持较短时间的基因沉默的siRNA
不适用于：大量筛选siRNA或长时间的研究，主要原因是价格因素
评价：★★★★★
6．PCR制备shRNA表达框生产siRNA
优点：成本较低，方便快捷，可以用于有效序列的筛选，可以用于质粒载体构建。
缺点：转染效率低，不适合大规模制备。
适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
评价：★★★☆☆