【转】在小鼠进行基因打靶的研究进展

drjiangbo · 发表于 2011-1-25 21:15:27

杨晓黄培堂黄翠芬
(军事医学科学院生物工程研究所, 100071. Email: yangx@nic. bmi.ac.cn)
摘要基因打靶是在生物活体研究基因功能的有效手段. 通过基因打靶可以对小鼠染色体组进行特异性的遗传修饰包括简单的基因剔除点突变的引入染色体组大片段的删除和重排以及外源基因的定位整合等. 近年来的研究表明, 对基因打靶进行时间和空间上的调控已成为可能.
关键词基因打靶基因剔除基因敲入染色体组工程
自20 世纪80 年代早期胚胎干细胞技术建立[1, 2]及13 年前第1 例基因剔除小鼠诞生以来在小鼠进行基因打靶的研究进展迅速, 给现代生物学研究带来了革命性的变化. 基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的可以改变生物活体遗传信息的技术手段.胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出来的多潜能细胞, 经过体外的培养和遗传修饰, 仍然具有分化的全能性. 它们经显微注射可被引入着床前的胚胎中, 并发育成包括生殖系在内的各种组织[3](图1). Smithies 最早于1985 年在哺乳动物细胞中实现了同源重组. 他和Capecchi 的研究小组两年后在胚胎干细胞中分别实现了基因的定位剔除[4, 5]. 目前在胚胎干细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术.

通过基因打靶获得的突变小鼠已近千种(相关数据库参见文献[6]), 并正以每年数百种的速度增加. 通过对这些突变小鼠的表型分析, 许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明, 并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展. 因此前任美国国立卫生研究院( N I H ) 院长Varmus 在第11 届国际小鼠基因组会议上
指出, NIH 敏锐地意识到小鼠遗传学通过一种动物整体的研究策略正在全面地改变科学的面貌. 目前人类全基因组序列分析已基本完成, 功能基因组学研究正在大规模地启动, 基因打靶已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一.现在, 研究者不仅可以通过简单的基因剔除改变活体的遗传信息也可以精确地在
小鼠染色体组中引入点突变, 甚至可以删除大至几个分摩的染色体组片段或制造特异的染色体易位. 对基因打靶进行时空上的调控也变成可能, 并成为在脊椎动物成体中研究基因功能的重要手段.
1 完全基因剔除(complete knockout)的策略
在ES 细胞中进行基因打靶最常用的策略依然是使用正-负双选择(positive-negative selection, PNS)载体[7]. 阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中[8, 9], 或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域[10]. 在许多研究中, 将b-半乳糖苷酶基因(lacZ)以正确的读框插入靶基因的外显子中, 除了剔除靶基因外, 通过分析b-半乳糖苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序. lacZ 基因5 端若携带内源核糖体插入位点(internal ribosomal entry sites, IREs), 则lacZ 基因的插入会不受时相的控制而得到正确的翻译[11](图2(a)).

图2 完全基因敲除载体
(a) 带lacZ 基因的PNS 载体, (b) 无启动子载体. 数字表示靶基因的外显子顺序
使用PNS 载体依然得到较多随机整合的 ES 克隆, 因为阴性选择基因(多为tk 基因)可能在转染及整合过程中失活, 从而导致打靶载体随机整合的ES 克隆得以生长. 启动子缺失的打靶载体可以进一步提高打靶载体的效率[12]. 载体中阳性选择标记基因neo 是不带启动子的, 只有发生正确的同源重组, neo 基因被精确地插入靶基因启动子后, 抗性基因才会表达, 并使ES克隆在选择性药物培养基中存活下来. 若在neo 基因5 端连接上IREs 位点, 则可以在任意外显子中插入而起相同的作用(图2(b)).
研究者对基因剔除后是否导致无义突变(null mutation)持越来越谨慎的态度. 尽管通常设计的打靶策略会摧毁靶基因最重要的功能域, 但只要染色体组中残留有任何编码序列, 就可能以末端删除或缺失突变的方式表现出来, 有时甚至会产生所谓的渗漏突变(leaky mutation). 这主要由于RNA 的异常拼接替代或隐微启动子的应用, 以及下游AUGs 翻译位点的启用等等. 所以在获得基因剔除小鼠后, 应在转录水平和翻译水平检测靶基因的活性. 若有残余蛋白质表达, 则应检测靶基因蛋白质的相关功能, 以便于对表型分析的结果得出正确的结论. 通过对渗漏突变进行严谨的分析可能得到无义突变研究无法获得的信息. 如fgfr2 基因的无义突变导致小鼠胚胎在胚胎移植到子宫中数小时后(E3.5)死亡表明胚胎移植和卵柱形成需要 FGFR2 介导的信号[13].而另一例渗漏突变的fgfr2 基因剔除小鼠在胚胎期E10-11 d 死亡, 突变小鼠没有四肢[14].一系列的研究证实FGF/FGFR2 信号是肢芽(limb bud)发生所必需的. 我们用基因剔除技术成功地研制了数种Smads 基因剔除小鼠[8~10],其中Smad3 基因剔除小鼠中有突变 Smad3 mRNA 的表达. 尽管其假想的翻译产物不具有生物活性所必需的受体结合功能域和磷酸化位点, 我们还是进行了多方面的功能实验以证实该基因剔除导致一个可能的无义突变[10].
2 大规模随机基因剔除基因捕获(gene trapping)
用常规方法进行基因打靶研究需耗费大量的时间和人力. 研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆, 绘制相应的物理图谱, 构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES 细胞等. 通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间. 面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息, 传统的基因剔除方法显得有些力不从心, 因此, 基因捕获法应运而生. 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库, 节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用, 更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析[15]. 基因捕获的策略如图3 所示. 典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因, 通常是neo 基因. neo 基因插入到ES 细胞染色体组中, 并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来. 从理论上讲, 在选择培养基中存活的克隆应该100%地含有中靶基因. 中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA 或染色体组序列分析来获得.

图3 基因捕获的常用策略
用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES 克隆. 这些克隆可以在96 孔培养板中生长复制并用于基因型分析. 大规模地保存和分析中靶ES 细胞在小型的实验室中也是可行的. 此方法的缺点是只能剔除在ES 细胞中表达的基因. 单种的细胞类型中表达的基因数目约为104, 现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES 细胞表达的基因, 因此, 在ES 细胞中进行基因捕获还是大有可为的. 1997 年后, 克隆技术接连取得重要突破, 用哺乳动物体细胞可以克隆出新个体[16, 17]. 可以设想在体细胞中应用基因捕获可以剔除更多在发育晚期才表达的基因, 其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体, 这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法. 用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰.

[信息] 【转】在小鼠进行基因打靶的研究进展